RESUMEN

La biotecnología a través de los años se ha involucrado en diferentes campos con actividades económicas y sociales, donde se ve inmersa la agricultura, la industria química y alimentaria, medio ambiente, medicina y veterinaria.  Los seres vivos están en constante evolución y con esta el avance de la biología del descubrimiento del funcionamiento de las células, como estas son las portadoras de la información genética y como producen proteínas, el estudio de la célula dio paso  para el desarrollo de técnicas para la manipulación  surgiendo  la ingeniería genética; herramienta de la nueva tecnología se empieza a trabajar sobre los genes y se empieza a explorar sobre la construcción de organismos transgénicos como las plantas y animales de esta manera se comienza a explorar sobre la organización de los genes en los cromosomas; desarrollando métodos de eficiencia y velocidad de secuencias nucleotídicas de los DNAs en los cromosomas  de los organismos vivos.

OBJETIVOS

Entender los diferentes procesos de cultivos In Vitro en las especies vegetales.

Determinar las diferencias en producción, resolución y resultados de las diferentes técnicas de manipulación genética vegetal.

Analizar las aplicaciones de la Biotecnología en las especies agronómicamente importantes.

ABSTRACT

The biotechnology through the years has become jumbled in different fields with economic and social activities, where it is immersed agriculture, the chemical and nourishing industry, environment, medicine and veterinary medicine.  The alive beings are in constant evolution and with this the advance of the Biology of the discovery of the operation of the cells, as these are the carriers of the genetic information and as they produce proteins, the study of the cell gave to passage for the development of techniques for the manipulation arising the genetic engeneering; tool of the new technology begins to work on the genes and it begins to explore on the construction of transgenic organisms as the plants and animal this way are begun to explore on the organization of the genes in the chromosomes; developing to methods of efficiency and speed of nucleotídicas sequences of the DNAs in the chromosomes of the alive organisms.

INTRODUCCION

En la antigüedad no se conocía la biotecnología ni la existencia de organismos invisibles a simple vista, pero la humanidad conoció muy temprano algunos procesos que, por ejemplo, daban como resultado el vino más exquisito y embriagante.

La biotecnología, según los especialistas, es precisamente eso: el empleo de células vivas para la obtención y mejora de productos útiles, como los alimentos y los medicamentos. Y, en el caso de los enólogos prácticos de las épocas más remotas, aprendieron que la cáscara de la uva contenía una levadura que, al fermentar, convertía la glucosa en alcohol.

Más cercana en el tiempo es la introducción de microorganismos en determinadas sustancias para generar productos esteroides, o compuestos biológicos como ácidos biliares y hormonas.

JUSTIFICACION

MARCO TEORICO

TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE

DEFINICIÓN ADN RECOMBINANTE

Técnica para aislar un gen e insertarlo en el ADN de otro organismo.  Esta técnica permite colocar fragmentos extraños de ADN en células tanto de bacterias simples como de plantas y animales complejos pudiendo transmitir la nueva secuencia a la descendencia.

TÉCNICA DEL ADN RECOMBINANTE

Se toma un gen de interés de un donador, se separa por medio de enzimas de restricción y luego se incorpora en un plásmido que replica esta información. El gen de interés se une al plásmido por medio de la ligasa y ATP.

 

PURIFICACIÓN O RECUPERACIÓN DEL ADN

 

INSERCIÓN DE ADN EN EL PLÁSMIDO

El ciclo celular

En 1839, Schleiden y Schwann propusieron la Teoría Celular estableciendo que cada organismo se componía de una o más células y que cada nueva célula sólo podía provenir de la división de alguna célula preexistente. Desde el comienzo de este siglo se sabe que en cada célula, los cromosomas portan la información genética. El conocimiento desde los años 50 de que el material genético es el ADN y la elucidación de su estructura, llevó a preguntarse acerca de su replicación. Hacia 1970 se conocía la composición básica de las

células y entonces comenzaron a abordarse interrogantes sobre los detalles moleculares de los procesos individuales de la vida celular.

Las células se reproducen duplicando y repartiendo sus componentes para constituir dos células hijas. El ciclo celular es el conjunto de procesos que van desde el momento en que la célula toma la decisión de dividirse hasta que origina dos células nuevas. Es por tanto la base de la proliferación celular. Tomando como modelo la levadura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) revisaremos losconocimientos que se tienen en cuanto a la regulación de la replicación en las células eucariotas [Nota 3]. Aunque los detalles de cada ciclo celular eucariota varían entre los organismos, los puntos esenciales son comunes. En un ciclo celular general (figura 1), para producir dos células hijas idénticas, el ADN se duplica, se segrega y finalmente la célula original se divide para dar lugar a dos células nuevas independientes, cada una con una dotación genética idéntica a la de su hermana.

Ciclo celular básico

Los ciclos celulares de la mayoría de las células también comprenden procesos que conducen a duplicar y dividir su masa y sus orgánulos citoplásmicos. Por lo tanto el ciclo celular es una compleja combinación de procesos citoplásmicos y nucleares muy bien coordinados entre sí.

¿Cómo se organiza el ciclo celular?

El alcance de nuestro conocimiento del ciclo celular ha sufrido una revolución en los últimos años. En el pasado, utilizando únicamente el microscopio óptico, los científicos dividieron el ciclo celular en dos periodos. Uno, de elevada actividad de reorganización y movimiento de los componentes subcelulares, denominado mitosis, en el que los cromosomas se condensan haciéndose visibles al microscopio óptico y que finaliza con los procesos de segregación y división celular. Y un segundo que comprende la mayor parte del ciclo celular, denominado interfase por transcurrir entre dos mitosis y en el que a microscopio óptico no se observa proceso activo alguno salvo el incremento en el tamaño celular. Hoy sabemos que la interfase no es un periodo de reposo sino que por el contrario es un periodo de gran actividad, durante el que se llevan a cabo en una secuencia ordenada complicados y elaborados preparativos para la división celular.

Efectivamente, durante la interfase y de forma continua tienen lugar acontecimientos conocidos en su globalidad como crecimiento y que incluyen la síntesis de nuevos orgánulos celulares y la mayor parte de las proteínas celulares.

Además, comprende procesos (figura 2) que ocurren de forma discontinua, como la replicación del ADN durante el periodo conocido como fase S -de Síntesis- El intervalo que transcurre entre el final de la mitosis del ciclo anterior y el comienzo de la síntesis de ADN se conoce como fase G1 –del inglés Gap- y el intervalo entre el fin de la fase S y la mitosis, fase G2.

 

Organización del ciclo celular

Las fases G1 y G2 proporcionan tiempo adicional para el crecimiento. Durante G1 la célula analiza si las condiciones ambientales son adecuadas para comenzar el proceso irreversible de la división celular, siempre que cuente con el tamaño mínimo para ello. En el caso de que la situación sea favorable, toma la decisión de atravesar el punto de Inicio (Start) que compromete irreversiblemente el comienzo del ciclo celular. Si las condiciones ambientales no son adecuadas para la entrada en el ciclo, la célula entra en un periodo de quiescencia, denominado G0, en el que puede permanecer largo tiempo. Además, desde este estadío de G0 la célula es sensible a señales de diferenciación, en el caso de organismos pluricelulares, o de inicio de procesos sexuales, en el caso de organismos unicelulares. Si las condiciones ambientales vuelven a ser favorables, la célula puede volver a iniciar ciclos de división. 

En la fase G2 la célula analiza si ha completado correctamente la fase S y decide entre permitir el paso a mitosis, o en su caso, esperar para que se realicen las reparaciones   necesarias.

Control del ciclo celular

La mayor parte de los estudios y los primeros avances sobre los mecanismos de control del ciclo celular en eucariotas se han realizado empleando como modelo las levaduras. 

Las levaduras son hongos unicelulares que presentan grandes ventajas como modelo de estudio del ciclo celular eucariota. Son organismos muy adecuados porque tienen tiempos de generación cortos, (90 minutos frente a las 24 horas que dura el ciclo de las células animales) y su genoma es alrededor de 100 veces menos complejo que el de una célula de mamífero, pero mantienen el mismo tipo de organización del ciclo celular que los eucariotas multicelulares. Además, es fácil de manipular genéticamente, siendo posible aislar mutaciones en genes que controlan procesos celulares básicos, clonar los genes identificados por esas mutaciones y realizar deleciones  de genes específicos, al ser las levaduras capaces de vivir como organismos haploides.

La mayor parte de los estudios de ciclo celular se han llevado a cabo empleando S.cerevisiae, la levadura del pan y la cerveza también conocida como la levadura de gemación por su característico estilo de división. En el caso de este organismo hay que añadir la ventaja de que actualmente se conocen los aproximadamente 16 millones de pares de nucleótidos que constituyen la secuencia completa de su genoma.

 

Ciclo celular de S. cerevisiae

Los fundamentos de nuestro conocimiento actual del ciclo celular en levaduras vienen de la búsqueda sistemática de mutaciones en genes que codifican para componentes de la maquinaria del ciclo celular realizada por Hartwell, Culotti y Reid en 1970 en Saccharomyces cerevisiae y Nurse, Thuriaux y Nasmyth en Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) conocida también como levadura de fisión- en 1976. Basándose en que la división celular es esencial para la proliferación de estos organismos, aislaron mutaciones que afectan al ciclo celular como mutaciones condicionales: inactivan un producto génico en unas condiciones pero no en otras. Las más comunes son las mutaciones termo sensibles en las que el producto del gen mutado funciona de modo normal a una temperatura, la temperatura permisiva, pero no a otra, llamada restrictiva. En la mayoría de los casos, las mutaciones termosensibles son permisivas a 20-25°C y restrictivas a 35- 37°C. De entre todos los mutantes termosensibles obtenidos se seleccionaron aquellos que afectaban a un gen del control del ciclo celular y que se diferenciaban del resto porque todas las células de una población que portan esa mutación se paran en el mismo punto del ciclo celular cuando se incuban a la temperatura restrictiva. A estas mutaciones, y por extrapolación a los genes a los que afectan se les llama cdc -Ciclo de División Celular-. Estos estudios han permitido identificar una familia de proteínas quinasas dependientes de ciclina, -Cyclin Dependent Kinases, Cdk- que incluyen a Cdc28 de S. cerevisiae, y a su homólogo en S. pombe cdc2, y que juegan un papel central en los procesos claves del ciclo celular: la entrada en ciclo, la síntesis de ADN y la regulación de la mitosis. Estas quinasas son las subunidades catalíticas de un complejo que incluye tambiénuna subunidad reguladora, denominada ciclina, necesaria para la función del complejo al determinar la localización o la especificidad de sustrato de la quinasa. Esta asociación de subunidad catalítica y reguladora define las funciones de la quinasa a lo largo del ciclo. En S. cerevisiae existen al menos 9 ciclinas que se asocian a Cdc28. Por su estructura se dividen en dos familias: ciclinas Cln –de Ciclina - que incluyen a Cln1, Cln2 y Cln3, que se necesitan para el paso de la célula por el punto de Inicio presente en G1, y las ciclinas Clb – de Ciclina tipo b - que incluyen a las seis restantes, Clb1-6, que son esenciales para la regulación de la entrada en fase S y en Mitosis.

En concreto, cada complejo Cdc28/Ciclina determina una función de la quinasa a lo largo del ciclo (figura 5). Los complejos Cdc28/Ciclinas Cln activan en G1 el paso por Inicio, la aparición de la yema y la degradación de Sic1, un inhibidor de los complejos quinasa Cdc28/Clb [Nota 6], de modo que inactivan la capacidad de las células haploides de pararse en G1 como respuesta a las feromonas sexuales, lo que proporciona el carácter de  irreversibilidad a la entrada en el ciclo celular. Los complejos Cdc28/Ciclinas Clb activan el inicio de la replicación, regulan la formación de los husos mitóticos y la división nuclear y el crecimiento isométrico de la yema en G2 y M.

Ciclo CDK de S. cerevisiae

En los últimos años se han encontrado también homólogos a estas quinasas en todos los eucariotas en los que se han buscado, y que incluyen desde el gusano nematodo Caenorhabditis elegans, a la mosca Drosophila melanogaster , a mamíferos como el ratón y el hombre y plantas como Arabidopsis thaliana, indicando que el sistema de control del ciclo celular es general en todos los eucariotas y validando a las levaduras como modelos de estudio.

El control de la fase S y el inicio de la replicación

Dentro del sistema de control central que desencadena los procesos esenciales del ciclo celular existen dispositivos bioquímicos que actúan para poner en marcha un proceso que inicia la fase S. ¿Cómo se inicia? Numerosos estudios acerca de los mecanismos de replicación del material genético y de su regulación han ido conduciendo progresivamente a la descripción de una serie de factores necesarios para su inicio y control. El Modelo del Replicón, inicialmente propuesto para la bacteria Escherichia coli -E. coli - (Bell et al., 1993) predice la existencia de secuencias de ADN desde donde se inicia la replicación. Posteriormente estas secuencias fueron identificadas en S. cerevisiae y se conocen como Secuencias de Replicación Autónoma (SRA) [Nota 7], las cuales coinciden con los orígenes de replicación. Los cromosomas de eucariotas son demasiado largos para ser replicados a partir de un solo punto como ocurre en procariotas, por lo que contienen varios orígenes de replicación. Los trabajos de Bell y Stillman de 1993 describieron un complejo de 6 proteínas que reconocen los orígenes de replicación, denominado Complejo de Reconocimiento del Origen (CRO). Estas proteínas son esenciales para la viabilidad celular y necesarias, pero no suficientes, para iniciar la replicación del ADN. Otras proteínas iniciadoras se han ido descubriendo paulatinamente, del tipo de Cdc6, las seis de la familia Mcm, la quinasa Cdc7 - y su ciclina Dbf4 - y Cdc45.

Las proteínas CRO permanecen unidas a los orígenes de replicación durante todo el ciclo celular, pero el resto de las proteínas iniciadoras forman o no parte del complejo dependiendo de la fase del ciclo, definiendo así un estado post-replicativo del origen presente durante las fases S, G2 y M (sólo permanecen unidas a los orígenes las proteínas CRO) y un estado pre-replicativo durante G1 (con el resto de las proteínas iniciadoras formando parte del complejo). El inicio de la replicación del material genético marca la transición entre el estado de complejo pre-replicativo (pre-RC) a complejo post-replicativo (post-RC).

 

Complejos post-replicativo (arriba) y pre-replicativo (abajo)

La actividad quinasa asociada a complejos Cdc28/Clb aparece al comienzo de fase S y aunque pueden detectarse complejos Cdc28/Clb5 y Cdc28/Clb6 ya en fase G1, éstos son inicialmente inactivos debido a la presencia de Sic1, quien regula la entrada en fase S regulando la actividad quinasa de los complejos Cdc28/Clb5 y Cdc28/Clb6. La función principal de los complejos Cdc28/Cln1 y Cdc28/Cln2 en promover fase S parece ser la degradación de Sic1 poco antes del comienzo de fase S.

Se ha propuesto un modelo de inicio de la replicación en dos fases sucesivas e interdependientes: primero tendría lugar el establecimiento de los complejos pre- RC en presencia de Cdc6 y con el reclutamiento de proteínas Mcm y Cdc45, y después se iniciaría la replicación del ADN promovido por la actividad quinasa debida tanto a Cdc28/Clb como a Cdc7/Dbf4, con el consiguiente desmontaje de los pre-RC

 

Activación del inicio de la replicación

Mantenimiento de la ploidía 

Si una célula inicia la replicación de su material genético más de una vez antes de dividirse, se encuentra con serios problemas a la hora de repartirlo durante la mitosis, de modo que las dos células resultantes tienen cantidades de material hereditario distintas entre sí y desiguales a la célula que inició ese ciclo de división celular. Semejantes defectos serían arrastrados en divisiones sucesivas haciendo inviables a las células resultantes. Parece vital, por tanto, llevar a cabo una replicación fidedigna y única por ciclo para que se mantenga la ploidía durante las sucesivas divisiones proliferativas de una célula.

El modelo de regulación del inicio de la replicación en dos pasos garantiza a la célula el mantenimiento de su ploidía. Si la condición necesaria para que los componentes requeridos para la formación de los complejos pre-RC se ensamblen es la ausencia de actividad quinasa, su presencia se requiere para la activación de dichos complejos y el inicio de la replicación. La subida de actividad quinasa en la transición G1/S (favorecida por la destrucción de proteínas inhibidoras de Cdc28/Clb) a la vez dispara el inicio de la replicación en los orígenes con la consecuencia del desensamblaje de los propios complejos pre-RC cuyo reensamblaje queda inhibido hasta una nueva fase G1 después de la bajada de

actividad quinasa que marca la salida de la mitosis y por tanto después de que el material genético previamente duplicado haya sido adecuadamente repartido. El mismo tipo de molécula (Cdc28/Clb) tiene un papel dual: una función positiva para permitir una función legítima (activación de los orígenes e inicio de la replicación del ADN en fase S) y una negativa, para impedir una función ilegítima (bloqueo del ensamblaje de nuevos complejos pre-RC durante las fases S, G2 y M). Cuando la actividad legítima ha sido ejecutada, se activa la ilegítima.

Lo que queda por saber

Afortunadamente para los estudiosos de esta materia, el asunto no está· zanjado. Aunque la actividad Cdc28 es decisiva en la regulación de la formación de los complejos pre-RC, sus substratos y el efecto de las fosforilaciones sobre ellos para dirigir su actividad, destrucción o localización subcelular, son poco conocidos. Los diferentes componentes de los complejos del origen son los candidatos de primera línea para establecer el nexo (Cdc6, Mcms, CRO). De hecho, ya se ha descrito la fosforilación por Cdc28 de varias de estas moléculas (Dutta & Bell, 1997) y existen evidencias recientes de la existencia de procesos de re-localización subcelular de moléculas claves para el control del ciclo celular. Esta última estrategia permite sacar del escenario al actor una vez representado su papel, con el fin de que su presencia no impida ni pasar al acto siguiente ni ejercer su papel a otro protagonista. Así, además de los mecanismos ampliamente descritos de destrucción proteolítica  o inhibición directa por otra proteína, ciertos actores pueden ser eliminados de escena mediante su secuestro en un escenario celular distinto al de su lugar de actuación (citoplasma, nucleolo). Este atractivo mecanismo ha sido descrito para las proteínas Mcm (Dutta & Bell, 1997).

El descubrimiento de los cambios que se producen en la cromatina para hacer posible el acceso de la maquinaria de replicación al ADN, así como todos los factores responsables de la elongación de las hebras de nueva síntesis, una vez iniciada ésta, vendrían a completar el escenario de uno de los procesos fundamentales en la vida celular: la replicación del ADN.

CONCEPTOS Y APLICACIONES BÁSICAS EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Establecimiento de cultivos vegetales in Vitro

Cultivos de tejidos: comprende un heterogéneo grupo de técnicas mediante las cuales un explante, (parte separada de un vegetal) se cultiva asépticamente en un medio de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas.

Aplicación de Cultivos: Fisiología, genética, bioquímica, la bioconversión y producción de compuestos útiles, el incremento de la variabilidad genética, la obtención de plantas libres de patógenos, la propagación de plantas, la conservación e intercambio de germoplasma.

El Explante: La elección de un explante está determinada por el objetivo a estudiar y la especie vegetal involucrada; Si el objetivo es la producción de callos, se puede utilizar explantes provenientes de diversas partes del vegetal (ápices o meristemas caulinares, hojas, entrenudos cotiledones, raíces, etc.

Para la obtención de haploides se cultivan anteras y en menor medida, inflorescencias, microsporas u ovarios, además para la obtención de plantas libres de patógenos y germoplasma se cultivan meristemas (Roca et al, 1991).

Tamaño del explante: Cuanto más grande sea, mayores son las posibilidades de obtener proliferación callosa. Se debe tener en cuenta la incidencia de otros factores que a menudo pueden alterar las respuestas de los explantes cultivados; entre estos factores (época del año en que se realizan los cultivos, especialmente cuando se obtienen de plantas de invernadero o campo, pretratamientos a los explantes y las condiciones de crecimiento de las plantas donantes de los mismos (Roca et al, 1991).

Medios de Cultivo: Se consideran no sólo sus componentes sino su preparación. En la actualidad existen innumerables formulaciones cada una de las cuales contiene entre 15 a 35 compuestos químicos que suministran: carbono, nutrimentos minerales, vitaminas, agente gelificante, sustancias reguladoras de crecimiento, entre otros. Las fuentes de carbono permiten la generación de alimento in Vitro y las más utilizadas son la sacarosa que se puede remplazar por glucosa, para el crecimiento de callos y suspensiones celulares se incorpora al medio mioinositol como fuente de carbono.

Propagación clonal in Vitro de plantas

Cultivos de Meristemas: De un explante se regenera una planta y en otros casos se puede estimular la formación de brotes múltiples. se espera a menudo lograr la formación de ramas axilares que puedan separarse y enraizarse.

Embriogénesis Somática: Se definen como embriones somáticos, asexuales o adventicios al resultado a partir de las células que no son el producto de la fusión de gametos. Son estructuras bipolares con un eje radical-apical y no poseen conexión vascular con el tejido materno, estas estructuras deben tener la capacidad de crecer y formar plantas normales (Roca et al, 1991).

Los embriones somáticos mantienen una similitud con los embriones cigóticos; sin embargo tanto in Vivo como in Vitro pueden sufrir algunas anormalidades en el desarrollo por ejemplo la fusión de cotiledones (Roca et al, 1991). La presencia de nitrógeno reducido es clave para la inducción de la embriogénesis somática y la maduración de los embriones (Roca et al, 1991).

Factores que afectan la embriogénesis somática: El explante, el medio de cultivo, los reguladores del crecimiento y las condiciones medio ambientales.

Organogénesis

Comprende el desarrollo de yemas o de meristemas radicales a partir de explantes (directamente) o de los callos. Varias partes de una planta pueden responder directamente a idénticas condiciones de cultivo y tales diferencias reflejan el estado fisiológico de la fuente del explante. Éste estado determina además los factores exógenos que se deben añadir o sustraerse del medio de cultivo para inducir la respuesta morfogenética requerida.

Factores Endógenos: Varían cuantitativamente de acuerdo con las condiciones ambientales, el genotipo, el tipo de célula, etc. Para que la organogénesis ocurra a partir de los callos, se deben producir cambios que conduzcan a la organización celular. Este proceso involucra diferenciación celular, interacción celular y reacción a señales específicas.

Factores que afectan la organogénesis: Relacionados con el explante como lo es su edad fisiológica y la ontogenia, su tamaño , el tejido y órgano de donde provenga así como el estado fisiológico de la planta madre y la época del año en que se realice el cultivo.

Micropropagación

 

Concepto: Es una multiplicación masiva de tejidos in Vitro a partir de diferentes porciones o explantes extraídos de tejidos u órganos mediante métodos asépticos.

Ventajas:  Incremento acelerado del número de plantas derivadas por genotipo, Reducción del tiempo de multiplicación, Posibilidad de multiplicar grandes cantidades de plantas en una superficie reducida, a bajo costo y con tiempos económicamente costeables, Mayor control sobre la sanidad del material que se propaga, Facilidad para transportar el material in Vitro de un país a otro con menos restricciones aduaneras, Posibilidad de multiplicar rápidamente una variedad de la cual solo existían pocos individuos.

Pasos en la Micropropagación

Establecimiento del cultivo aséptico: Después de realizar la selección del explante, es necesario la desinfección del tejido para evitar el crecimiento de microorganismos y hongos que competirían con las porciones de tejido extraído, esta desinfección puede realizarse con diferentes compuestos (Hipoclorito de sodio y de calcio, peróxido de hidrogeno, nitrato de plata, cloro comercial y diferentes concentraciones de alcohol).

Crecimiento del inoculo: La porción del tejido extraído se multiplica con o sin la formación de callos, dependiendo del cultivo el crecimiento puede deberse a la división de las células, el aumento de tamaño o a las dos posibilidades; pero cuando existen fines de Micropropagación la formación de callos se evita, debido a que las plantas que vienen de los callos pueden tener algún grado de variación que puede ser epigenético, (que se define como los cambios reversibles de ADN que hace que unos genes se expresen o no dependiendo de condiciones exteriores) o mutaciones verdaderas.

El Enraizamiento de los brotes y preparación para su trasplante: Se necesita de un trasplante a un medio de cultivo con concentraciones de sales más bajas, se requiere a su vez un cambio en el balance hormonal, que puede ser por la disminución de citocianinas y el aumento de axinas, aunque depende de la especie, sólo con eliminar las citocianinas es suficiente para estimular la diferenciación del sistema radical.

Factores que influyen en la Micropropagación

Planta que dona el explante: El estado en el cual se encuentra la planta donante es determinante a la hora de su desarrollo e influye en su capacidad morfogenética, los requerimientos de cada planta varía de acuerdo a la edad y ésta a su vez influye a la morfogénesis, entre más joven sea la planta se garantiza que el tejido este menos diferenciado y la respuesta será mejor en el cultivo.

Posición de las yemas: Las yemas extraídas de la porción media del tallo se desarrollan más rápido que las obtenidas de la base.

El Explante: Parte de tejido u órgano que se aísla del resto de la planta con fines de cultivo, pero en la selección de este tejido se tiene en cuenta cómo se propaga cada planta.

Factores físicos: Son determinantes en la Micropropagación. Luz (esencial en la morfogénesis e involucra varios componentes como la intensidad, el fotoperiodo y la calidad, y a pesar de ser tan importantes sus estudios son escasos), temperatura (controla la incubación para la propagación).

Medio de cultivo: Composición química y forma física es diferente de acuerdo al tejido que se use.

Micropropagación de Especies Herbáceas: Basada en diferentes procesos morfogenéticos:

Estímulo de yemas axilares: Incitado por las condiciones in Vitro que facilitan la formación de una planta por cada yema, la eficiencia está determinada por el número de yemas axilares preexistentes en el inoculo, el sistema muestra gran estabilidad genética en individuos regenerados.

Diferenciación de brotes adventicios: Permite la formación de estructuras unipolares nuevas y así una mayor regeneración de brotes que en el sistema de yemas axilares, la variabilidad fenotípica en clones diferenciados esta dado por la formación del tejido meristemático y posterior diferenciación de ápices.

Embriogénesis somática: Es el sistema más eficiente, considerando la eficiencia como el número de plantas regeneradas por unidad de tiempo (Roca et al,1991).

Micropropagación de Especies Leñosas: Forestales y coníferas; las estacas pierden la capacidad para enraizar a medida que el árbol de origen es más viejo, los árboles usados como patrones deben ser los suficientemente maduros para que expresen su potencial genético. Los explantes, el tipo de brotes y el medio han permitido un cultivo exitoso. Los brotes adventicios se pueden producir a partir del explante directamente, o a partir de callos, la micropropagación es más fácil empleando explantes juveniles.

Cultivo de Protoplasto

Componentes vivos de las células vegetales que están rodeados sólo por la membrana plasmática; constituyen las células desnudas de una planta. Debido a la ausencia de la pared celular, los protoplasto son adecuados para diversas y diferentes manipulaciones genéticas que no serían posibles con plantas o células intactas; sirven además como herramientas experimentales únicas para muchas investigaciones fisiológicas, biofísicas y bioquímicas.

Aislamiento de Protoplasto: El método enzimático consiste en incubar las células en una mezcla de enzimas que degradan la pared celular. Para ello se debe considerar: el tipo de enzimas, la composición del medio y el material de origen de los protoplasto.

Características de los Protoplasto aislados: Contienen cloroplastos verdes y en la luz muestran actividad fotosintética (del mesófilo), contienen muchas veces almidón (de las suspensiones celulares).Los protoplasto del mesófilo constituyen una fuente adecuada para el aislamiento de cloroplastos. Una de las aplicaciones de la técnica de aislamiento de protoplasto es el cultivo de los mismos hasta obtener la regeneración de las plantas.

El éxito en el cultivo de los protoplasto depende de factores como: el tipo y edad del material de origen de los protoplasto, el sistema de cultivo y la densidad de los protoplasto. En cuanto a los protoplastos obtenidos de suspensiones celulares, el éxito depende de la calidad de suspensión utilizada; los protoplastos de suspensiones celulares que están en crecimiento logarítmico comienzan a dividirse muy rápidamente, mientras que los derivados de suspensiones más viejas regeneran la pared y se dividen con menos frecuencia.

Regeneración de las plantas: En muchas especies, la iniciación de los brotes requiere el uso de las citocininas y la regeneración de la planta se da por la diferenciación separada de la raíz y del brote. Si se utilizan protoplastos de cultivos celulares formadores de embriones, las células recién formadas pueden producirlos directamente por embriogénesis somática.

Ingeniería Genética y cultivo de tejidos

Ofrece, por medio de la biotecnología agrícola, nuevos elementos de análisis a nivel de las moléculas, las células y los tejidos para comprender mejor las características agronómicas de las plantas y por consiguiente, poder manipularlas.

Por ejemplo: La tecnología del ADN recombinante se utiliza para modificar ciertos caracteres unigénicos como la resistencia vegetal a virus e insectos, el incremento de la calidad nutricional de las plantas mediante la inserción de proteínas que son ricas en aminoácidos esenciales y que puede ser codificada por un solo gen.

El cultivo de tejidos vegetales in Vitro se ha convertido en el eje sobre el cual giran nuevas tecnologías del mejoramiento genético de las plantas y un mejor conocimiento de los procesos genéticos y fisiológicos de estas.

Transformación genética en los vegetales: Se emplean técnicas como la microinyección, las propiedades biológicas de la bacteria del suelo Agrobacterium sp para introducir el ADN foráneo. Limitante: Se deben establecer sistemas de obtención de protoplastos y de regeneración de plantas a partir de ellos.

Inyección directa de moléculas de ADN en los retoños florales y la llamada agroinoculación, también se han desarrollado sistemas de microinyección de ADN en embriones, ya que se pueden regenerar plantas a partir de ellos (Roca et al, 1991). La transformación de las células de la planta después de ser infectadas con Agrobacterium se debe a un plásmido de elevado peso molecular denominado plasmido-Ti que es transportado por esa bacteria; parte de ese plásmido será transferido al genoma de la planta el cual se expresará más tarde.

Aplicaciones de la Biotecnología Vegetal: Para obtener plantas tolerantes a virus, patógenos e insectos, resistentes a los herbicidas y adquirir una mayor calidad nutricional.

La introducción de genes dentro de las plantas es una técnica muy promisoria para lograr plantas tolerantes a infecciones virales. El término Protección cruzada ha sido utilizado para identificar la protección obtenida por una planta después de su inoculación con una cepa benigna de un virus, que la protegería de la infección causada por una cepa virulenta del mismo virus, es posible conferir tolerancia a los virus utilizando métodos que regulen la expresión de la ARN viral, una vez se halle éste dentro de la célula.

PRINCIPIOS BÁSICOS EN BIOTECNOLOGÍA ANIMAL

JUSTIFICACIÓN

La biotecnología aplicada al mejoramiento genético, especialmente frente a sus últimos adelantos, tiene muchos detractores, principalmente justificados en causas medioambientalistas. Vale la pena hacer una revisión a su historia y sus bases para reconocer su valor, fundamentalmente en los aspectos de salud humana pues siempre se habla en contra de los cultivos transgénicos para la alimentación y desconocen si reciben medicamentos originados en organismos genéticamente modificados.

DEFINICIÓN ADN RECOMBINANTE:

Técnica para aislar un gen e insertarlo en el ADN de otro organismo.  Esta técnica permite colocar fragmentos extraños de ADN en células tanto de bacterias simples como de plantas y animales complejos pudiendo transmitir la nueva secuencia a la descendencia.

 

La biotecnología tiene sus  orígenes se remontan a los inicios de la historia de la humanidad. Nuestros primitivos iniciaron hace alrededor de 10.000 años, durante la Edad de Piedra, la práctica de utilizar organismos vivos y sus productos cuando comenzaron a mantener animales domésticos y a crecer plantas para su alimentación, en vez de depender únicamente en lo que pudieran cazar o recolectar. La posibilidad que ofrece la "biotecnología moderna" es que presenta sistemas radicalmente novedosos para alterar o modificar las propiedades genéticas de los organismos en una forma totalmente dirigida. Por consiguiente, es un término nuevo que se ha dado a la evolución y recientes avances de la ciencia de la genética. Aunque la mayor parte de la información que ha hecho posible el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante, y por consiguiente los avances en biotecnología moderna, ha sido lograda en las últimas 4-5 décadas, la historia realmente se inicia hace más de 130 años atrás, con las investigaciones independientes de Charles Darwin y  Mendel. Las contribuciones de Darwin (considerado por algunos como el padre de la biología moderna), recibieron reconocimiento inmediato, aunque este reconocimiento no siempre era favorable. Darwin en sus estudios concluyó que las especies no son fijas e inalterables, sino que son capaces de evolucionar durante el tiempo, para producir nuevas especies. Las investigaciones de Mendel revelaron las reglas básicas que controlan la herencia. Él originó el concepto del “gen”, aunque este término no se utilizó sino hasta comienzos del siglo XX. A pesar de que Mendel describió el comportamiento esencial de los genes, sus experimentos no revelaron la naturaleza química de las unidades de la herencia. Esto ocurrió hacia la mitad del siglo XX e involucró muchos trabajos de diferentes científicos de todo el mundo, durante varias décadas.

Ingeniería genética en animales

Todo organismo, aun el más simple, contiene una enorme cantidad de información. Esa información se repite en cada una de sus células organizada en unidades llamadas genes, los cuales están formados por ADN. Los genes controlan todos los aspectos de la vida de cada organismo, incluyendo metabolismo, forma, desarrollo y reproducción.

Rompimiento de genes y remplazo génico en ratones

La influencia de los genes en la conducta animal ha sufrido grandes avances a finales de la década de 1990, cuando los neurocientíficos del desarrollo fueron capaces de alterar o romper (knock out) genes concretos. Hasta el punto de que se han vinculado rasgos concretos con genes concretos.

Por ejemplo, son especialmente valiosos los estudios realizados de los hábitos de recolección de comida de los gusanos (Caenorhabditis elegans) y de las moscas de la fruta (Drosophila melanogaster).

Los ratones son los modelos más importantes de mamíferos, ya que mucha de la tecnología desarrollada en ellos puede ser aplicada en los humanos. Dos técnicas son capaces de romper los genes (generalmente para un estudio de genética reversa) y para remplazar un alelo por otro. Para eso existen diferentes ejemplos de éstas. Las rupturas de los genes son algunas veces llamadas Knock-outs. Un organismo portador de genes knockout puede ser examinado por sus fenotipos alterados. Por lo general los ratones Knockout son modelos invaluables para estudiar mutaciones que se pueden encontrar en humanos o en otros animales; por ejemplo los ratones knockout que han perdido las enzimas de reparación de ADN vitales han sido creados para el estudio de estas enzimas en las tasas de control de cáncer.  Nadie ha modificado genomas humanos para observar qué pasa en la mente humana (por motivos éticos, básicamente), pero hay pruebas que sugieren que los genes desempeñan en el desarrollo de la mente humana más o menos el mismo papel que en la mente animal.

Las malformaciones o anomalías congénitas son alteraciones o defectos estructurales o funcionales presentes en el momento del nacimiento y originadas en una falla en la formación de uno o más constituyentes del cuerpo durante el desarrollo embrionario.
El término "congénitas" se refiere a las características adquiridas durante el desarrollo embrionario. Tales características pueden o no ser hereditarias. Al decir "constituyentes del cuerpo", se hace referencia a diferentes niveles de organización, desde el molecular al orgánico.

 
La disciplina  científica encargada del estudio de las malformaciones congénitas se denomina Teratología.

 

 Producción de ratones knock-out portadores de la mutación blanco.

Producción de ratones knock-out portadores de la mutación blanco: Para la producción de los ratones knockout las células embrionarias (ES) son aisladas de una cepa de ratón agutí coloración silvestre), portador del gen blanco para la mutación en un cromosoma. Las células ES son luego insertadas dentro de embriones jóvenes. El color del pelaje en los futuros ratones es la guía para determinar si las células ES insertadas han sobrevivido en el embrión, en la ausencia de las células de las ES los ratones pueden adquirir una coloración negra total en su pelaje. Cada embrión es obtenido a partir de ratones negros que perdieron el alelo dominante para el color silvestre. Una vez los embriones son alterados, se colocan dentro de una madre sustituta. Los descendientes con coloración mezclada de agouti y negro indican que las células ES insertadas han sobrevivido y roliferado en el animal; este tipo de ratones son denominados Quimeras debido a que ellos contienen células derivadas de dos cepas diferentes de ratones.

Terapia génica en animales

 El enfoque general de la terapia génica no es más que una extensión de la técnica de clonación selectiva por complementación funcional. Las funciones ausentes del receptor generadas por su gen defectuoso son introducidas mediante un vector que se inserta dentro de un cromosoma del receptor y por lo tanto genera animales transgénicos genéticamente “curados”, esta técnica es de gran potencial ya que ofrece la esperanza de corregir enfermedades hereditarias.

Aplicaciones de la Biotecnología en la producción animal

 La clonación génica y la transferencia de tecnología han generado nuevos métodos para alterar los genomas de anados que mejoren la calidad de los productos animales. Estas técnicas permiten el mejoramiento genético como complemento de la crianza selectiva convencional. Las especies domesticas son actualmente importantes en las investigación biológica y la aplicación tecnológica porque estas tienen diversos productos de valor comercial y además algunas un periodo corto de gestación. Las alteraciones biotecnológicas pueden generar un significativo impacto en la calidad de la carne cambiando los valores nutricionales, también se han producido ganados transgénicos que expresan una proteína heteróloga (proteína activadora del plasminógeno) con grandes efecto farmacéuticos.

Biorremediación

La agricultura intensiva es una de las actividades humanas que tienen mayor repercusión en la contaminación del suelo por metales pesados, debido al empleo de fertilizantes y plaguicidas de forma prolongada. Los fertilizantes fosforados pueden contener Zn, As, Cd y Pb debido a su presencia en la roca fosfórica. El uso de ciertos plaguicidas han contribuido a aumentar los niveles de As, Pb, Hg, Cu, algunos poseen concentraciones de Zn que pueden superar el 25 %. Solucionando grandes problemas ambientales con la ayuda de pequeños amigos: las técnicas de biorremediación. Podemos definir biorremediación como la utilización de seres vivos para solucionar un problema ambiental, tales como suelo o agua subterránea contaminados. En un ambiente no contaminado, las bacterias, los hongos, los protistas, y otros microorganismos heterotróficos degradan constantemente la materia orgánica disponible, para obtener energía. Cuando un agente contaminante orgánico, combustible, petróleo u otro es accidentalmente liberado en un ambiente dado, algunos de los microorganismos indígenas morirán, mientras que sobrevivirían algunos otros capaces de degradar estos compuestos orgánicos. La biorremediación trabaja proveyendo a estos organismos de nutrientes, oxígeno,y otras condiciones que favorezcan su rápido crecimiento y reproducción. Estos organismos entonces podrán degradar el agente contaminante orgánico a una velocidad mayor, proporcionando una técnica para limpiar la contaminación, realzando los mismos procesos de biodegradación que ocurren naturalmente en el medio ambiente. Dependiendo del sitio y de sus contaminantes, la biorremediación puede ser más segura y menos costosa que soluciones alternativas tales como la incineración o el enterramiento de los materiales contaminados.